化学机械法(APMP)棉秆制浆废液中含有多种有机物和无机物，很多能为微生物所利用[]。采用制浆废液培养有益微生物，将转化液用于土壤的生物修复和农业种植中，可减少化学农药的用量，利于植物的病害防治，且不会使目标病原菌产生抗药性[]。枯草芽孢杆菌是一种重要的工业微生物，能自身合成消化性酶类，又能够产生耐热、耐旱、抗紫外线的内生芽孢、活性蛋白、细菌素等抗菌物质，是理想的生防菌[]，也是生物膜系统中发现较早的好氧芽孢杆菌属[]，对作物有良好的抗病、抑菌效果，抑制多种病原真菌和病原细菌，是一种对人畜无害，无污染的微生物益生菌[, ]。Yang等[, ]利用APMP棉秆制浆废液发酵生产枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)SY1，并将该转化菌液(含有废液本身的营养成分以及Bacillus subtilis SY1的活菌体和代谢产物)应用于盆栽和田间土壤系统中，证实了对田间作物种植的安全性，且能促进作物的生长。

　　枯草芽孢杆菌的发酵培养是大规模生产芽孢杆菌制剂的前提[]。利用APMP棉秆制浆废液发酵培养枯草芽孢杆菌，不仅可以扩大培养菌株数量，还可以将废液中的成分进行转化和利用。因此，为优化枯草芽孢杆菌生物转化条件及验证枯草芽孢杆菌生物转化液对生产者和其它生物的安全性，本实验考察了枯草芽孢杆菌在棉秆制浆废液中的适宜发酵条件以及转化液的毒性试验，为土壤生物修复及安全性提供理论依据。

　　1.1.1 菌种：Bacillus subtilis SY1为实验室保藏菌种，是芽孢杆菌属的一种。

　　1.1.2 原水水质：化学机械法(APMP)棉秆制浆废液：取自天津某造纸厂棉秆双螺旋机械浆生产线中预浸、挤浆和磨浆工段产生的中间废水。废液主要成分见所示。

　　1.1.3 培养基：LB基本固体培养基，用于平板涂布计数，测定活芽孢数。

　　1.1.4 生物转化装置：小试反应装置如所示。反应装置为有机玻璃圆柱体，内径8.5 cm，高44 cm，体积为2 L，装置中装有1.5 L经过厌氧处理后的废液。反应器内装有填料，采用鼓风曝气，转子流量计调节曝气量。反应器中设有温度控制器，保持温度在25-35 ℃，间歇式运行，采用蠕动泵出水。

　　1.1.5 反应器填料：实验填料采用柱状填料，直径25 mm，比表面积为155 m2/m3，孔隙率为0.87，堆积个数53500/m3，堆积重量86.5 kg/m3，填料投加比例为30%，在反应器中随水流成流动状态。

　　1.1.6 试验动物：SPF级Wistar种大鼠和普通级大耳白兔，为天津市疾病预防控制中心提供的合格动物。38只Wistar种大鼠雌雄各半，8只大耳白兔雌雄各半。

　　棉秆制浆废液经厌氧处理后，废液COD为13553 mg/L，BOD为8350 mg/L，B/C=0.62。将枯草芽孢杆菌以0.8 g/L的接种量接入厌氧处理过的棉秆制浆废液中，pH7.0，温度30 ℃，曝气量16 L/h，反应器内加入填料，装填度为30%，生化反应时间为30 h，即得棉秆制浆废液转化液(以下简称转化液)。

　　经水浴加热后稀释，移取0.1 mL至LB固体培养基中进行均匀涂布，恒温培养48 h后计算菌落数[]。每次实验重复3次，取平均值。

　　废液COD的测定采用重铬酸钾法[]；废液BOD5选用仪器CY-Ⅱ差压式直读BOD5测定仪进行测定[]；pH值采用精密pH计进行测定；总氮采用紫外分光光度法测定；氨氮采用纳氏试剂分光光度法；总磷采用钼锑抗分光光度法测定；总糖、还原糖的测定采用费林试剂热滴定法[]。

　　将菌种以0.8 g/L接种量接种于pH值为7.0，且经厌氧处理后灭菌的废液中，在温度为30 ℃、曝气量为16 L/h的条件下，进行培养。每10 h取样后，用平板涂布计数转化后废液中的菌数。绘制枯草芽孢杆菌的生长曲线。

　　实验选择初始pH值、温度、曝气量和填料等因素进行单因素实验。由细菌生长机理来看，选择pH水平分别为6.0、7.0、8.0和9.0作为反应条件；温度选择20、25、30和35 ℃作为转化条件；曝气量与反应器中溶解氧含量相关，选择8、12、16、20和24 L/h作为反应条件，相同条件下未加填料和加填料作为反应条件。转化液菌数在30 h时进行测定。

　　按照HJ/T154-2004《新化学物质危害评估导则》中急性经口毒性试验、急性经皮毒性试验、急性眼刺激试验、急性皮肤刺激试验的有关要求进行试验[]。

　　2.1.1 枯草芽孢杆菌的生长曲线：枯草芽孢杆菌和其他细菌一样，其生长曲线可以分为迟缓期、对数期、稳定期和衰亡期，在APMP制浆废液生物转化条件下，枯草芽孢杆菌的生长曲线()。

　　从可以看出，0-10 h为迟缓期，10-30 h枯草芽孢杆菌菌数成对数增长，属于细菌生长曲线的对数期，当生物转化时间为30 h时，废液中菌浓度最大，达到5.57×109 CFU/mL，表明了该废液适于枯草芽孢杆菌的生长[]。而图中并未出现稳定期，其原因可能为取样时间间隔太长，在30-40 h期间达到稳定期后没有得到显示。40 h以后菌数明显下降，主要是由于废液中营养物质被分解利用而不断减少，新生细菌没有足够的营养进行生长繁殖，符合了微生物生长曲线的衰亡期。因此，实验采用培养时间为30 h，此时枯草芽孢杆菌进入对数生长期，既可保持高的细胞活力，又可获得较大的细胞量。

　　2.1.2 温度的确定：温度主要是通过改变酶反应速率来影响菌体的生长，反应器温度过低或过高均会影响菌株的生长[]。在初始pH7.0，温度30 ℃，曝气量16 L/h，接种量0.8 g/L，不同温度条件下的废液转化情况见。

　　由表明，当温度为20 ℃时，菌体生长受到明显抑制，活芽孢数最低，可见低温并不利于菌体在制浆废液中的生长繁殖。温度对菌体生长有较大影响，30 ℃时发酵液中活芽孢数及COD去除率都优于其他温度，活芽孢数量达到5.57×109 CFU/mL，COD去除率为59.2%。因此，确定培养枯草芽孢杆菌较适宜的培养基温度为30 ℃。

　　2.1.3 初始pH值的确定：环境的酸碱度对微生物的生命活动有很大的影响，不同的细菌最适pH值不同[]。由于生物转化过程中的pH难以控制，只能控制转化液的初始pH[]。在温度30 ℃，曝气量16 L/h，接种量0.8 g/L，不同pH值条件下，实验反应30 h后测定活芽孢数和COD去除率，实验结果见。

　　在初始pH值为6.0时，活芽孢数为3.87×109 CFU/mL，COD去除率低于30%，而随着pH的升高，活芽孢数和COD去除率均有明显增加。在pH值为7.0时，发酵液中活芽孢数达到最多，且此时的COD去除率最高。当pH值为8.0时，菌体生长受到抑制，活芽孢数量及COD去除率同时出现下降。因此，确定培养枯草芽孢杆菌较适宜的培养基初始pH值为7.0。

　　2.1.4 曝气量的确定：枯草芽孢杆菌属于好氧微生物，曝气不仅可以为微生物提供溶解氧还可以提高氧的传质速率[]，增加菌体与废水的接触面积[]。在初始pH7.0，温度30 ℃，接种量0.8 g/L，不同曝气量条件下活芽孢数和COD去除率，结果如所示。

　　利用溶氧仪测量曝气为8、12、16、20、24 L/h时，反应器内的溶解氧的量分别为1.9、2.3、6.5、6.7、6.7 mg/L。由可知，当曝气量为16 L/h时，活芽孢数和COD去除率均最高，因此，此时反应器中的溶解氧已经达到饱和，为枯草芽孢杆菌的生长繁殖提供了充足的氧气。通过对以上5个曝气量的分析，发现在一定的曝气量范围内，曝气量越大，越利于COD的降解和枯草芽孢杆菌的生长，但是由于曝气量加大容易使废液发泡，废液蒸发量也会增加，过大的曝气量不利于菌株的生长，甚至会产生毒害作用，且曝气能量消耗增加，综合考虑，选择曝气量为16 L/h的条件较为合适。

　　2.1.5 反应器内填料的添加对生物转化效果的影响：反应器中添加载体，富集培养生物膜，可增加污水与微生物的接触面积提高生物转化效率，对废水中的COD、氨氮、磷酸盐等具有一定的去除效果[]。

　　由可以看出，当反应器中有填料存在时，有助于促进废液的生物转化，细菌生长到对数期时，COD的去除率可达70.4%，比未加填料提高了16.2%，添加填料后转化液中的菌数比未加填料的转化液增多12.57%。说明反应器中加入填料可以使细菌在填料上附着，增加细菌在废液中的停留时间，有利于枯草芽孢杆菌的生长和COD的去除[]。

　　2.1.6 生物转化前后APMP棉秆制浆废液成分对比：在最佳生物转化条件下，利用棉秆制浆废液转化枯草芽孢杆菌后，原液和转化液经离心后，上清液的成分分析结果如所示，APMP棉秆制浆废液转化枯草芽孢杆菌后，转化液的成分与转化前相比均有不同程度的降低，说明在生物转化过程中枯草芽孢杆菌消耗了大量的有机物，其中，该菌株对总糖中的还原糖利用率较高，同时废液中含有一定量的磷和氮，为该菌株的生长和代谢提供了必要的营养[]。

　　枯草芽孢杆菌转化后的APMP棉秆制浆废液，因含有大量具有生物防治功能和促生作用的枯草芽孢杆菌，因此可以用于修复病害微生物污染土壤，为研究转化液的安全性，开展了一系列急性动物实验。

　　2.2.1 急性经口毒性实验：按HJ/T154-2004《新化学物质危害评估导则》对28只，雌雄各半的SPF级Wistar种大鼠做急性经口毒性实验，染毒后至少每日观察1次，连续观察14 d，记录观察期内动物中毒症状、死亡状况、体重，对死亡动物进行尸体解剖。为急性经口毒性实验对大鼠体重的影响。

　　以10.5 g/kg·(BW)受试物经口染毒后，动物未见明显中毒症状，观察期间内无死亡。可见，动物体重呈增长趋势，尸检中各主要器官未见明显异常。病理检查结果发现，染毒组及对照组动物病理检查均未见明显异常。

　　于染毒后第1、7、14、21天收集动物粪便，同时采集血液，剖解动物的心，肝，肺，肾，脑，睾丸(卵巢)，提取组织样品DNA后进行PCR扩增，对扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳实验。

　　由电泳结果可以得出，样品已成功扩出，通过与DL2000 Marker对比，其片段大小为100 bp左右，PCR扩增效果良好。而在粪便的PCR扩增产物中除DNA扩增片段外，多了一条与菌液扩增物一致的条带，且该条带比较明显，说明经口染毒后大鼠体内含有受试物，经粪便排放出现在粪便中，在心、肝、脾等其它器官中并未显示有受试物扩增条带的出现。经口染毒第7、14、21天后粪便中受试物扩增条带消失，表明粪便中受试物被清除至检验水平之下，大鼠体内基本无菌液的残留，且心、肝、脾、肾、脑、睾丸(卵巢)及血液等器官中也未出现明显条带，说明染毒后大鼠未受到菌液毒性的影响。

　　实验结果表明，染毒组及对照组动物病例检查均未见明显异常，以10.5 g/kg·(BW)受试物经口染毒后，动物未见明显中毒症状，观察期内无死亡。动物体重呈增长趋势，尸检中各主要脏器未见明显异常，LD50≥10.5 g/kg·(BW)。

　　2.2.2 急性经皮毒性实验、急性眼刺激实验和急性皮肤刺激实验：经HJ/T154-2004《新化学物质危害评估导则》对普通级大耳白兔做急性经皮毒性、急性眼刺激和急性皮肤刺激实验，观察记录受试动物的中毒症状、死亡数、眼睑刺激反应和皮肤刺激反应。结果表明，涂抹受试物后

　　皮肤没有出现明显感染状况，观察期内无实验动物死亡。经皮LD50≥2500 mg/kg体重；眼刺激实验结果为1-2级；生物转化液皮肤刺激试验分值＜0.5。

　　综上所述，经急性经口毒性、急性经皮毒性、急性眼刺激和急性皮肤刺激四种实验，根据《新化学物质危害评估导则》HJ/T154-2004分级标准表明，该生物转化液为无刺激性、无毒性物质。

　　棉秆制浆废液中含有木质素、纤维素、蛋白质等多种营养成分，经处理后有利于微生物的生长，对枯草芽孢杆菌在APMP棉秆制浆废液厌氧处理后废液中的适宜发酵条件及转化液的安全性进行了考察。结果表明，厌氧处理后棉秆APMP制浆废液培养枯草芽孢杆菌的最适条件为：初始pH7.0，温度30 ℃，曝气量16 L/h，接种量0.8 g/L，反应器内加入填料；在此培养条件下菌株的活芽孢数为6.27×109 CFU/mL，废液COD转化率达70.4%。生物转化结束后，转化液的成分含量与转化前相比均有不同程度的下降，说明棉秆APMP制浆废液可为枯草芽孢杆菌的生长和代谢提供必要的营养。经过四种毒性试验结果表明，该生物转化液未发现生物致病性，因此，可以被应用于农田土壤修复和蔬菜种植中的蔬菜促生，而不会给自然环境和人类带来副作用。